中国学术杂志网

胚胎植入诊断运用发展

 论文栏目:现代妇科发展论文     更新时间:2012-10-28 17:25:03   

本文作者:牛子儒 岳晓静 侯彩英 姚元庆 单位:中国人民解放军总医院妇产科 中国人民解放军第二炮兵清河门诊部

2010年诺贝尔生理与医学奖颁给了“试管婴儿”之父Edwards,标志着人类辅助生殖技术的成功。随着分子生物学、遗传学和生殖医学的发展,第三代试管婴儿技术时代来临,我国辅助生殖技术也不断迈进,胚胎冻融技术、卵泡浆内单精子注射(intracytoplasmicsperminjection,ICSI)技术广泛应用,在人工助孕与显微操作的基础上,胚胎植入前遗传学诊断(pre-implantationgeneticdiagnosis,PGD)正高速发展并逐渐应用于临床,这使不孕不育的夫妇不仅能喜得贵子,并且能实现优生优育。通过复习文献,本文就近年来胚胎植入前遗传学诊断应用进展做一简要综述。

1概述

1.1简介胚胎植入前遗传学诊断主要是指采用快速遗传学诊断方法,选择无遗传学疾患的胚胎植入宫腔,从而获得正常胎儿的诊断方法,具体操作:待体外受精的胚胎发育到4~8细胞期,显微操作下行卵裂球细胞活检,取出1个或2个细胞,或者直接取受精前后的极体,对它们行聚合酶链反应或免疫荧光原位杂交分析。广义的PGD还包括受精前配子的诊断,如:精子的筛选和分离、精子或卵子基因型的检测、极体的活检等。种植前遗传学筛查(PGS)是近十几年出现的以提高妊娠率、活产率为目的的早期产前筛查方法。通过对染色体数目异常的筛。≡袢旧搴诵驼5呐咛ソ幸浦。PGS是一种低危险度的PGD,欧洲人类生殖和胚胎学协会(ES-HRE)PGD协作组报告的PGS周期数占PGD一半以上[1],并逐年增加。PGS适用于高龄、反复种植失败、非染色体结构异常的重复性流产等不孕不育夫妇,获得可接受的妊娠率。但对其有效性尚存争议[2]。应用PGD使胚胎植入子宫前的染色体分析成为可能。胚胎染色体异常不仅易导致自然流产,并且可能是导致许多不孕妇女不能解释的多次种植失败的原因[3]。PGD理论雏形是1967年由Edwards等率先提出的,他在小鼠胚泡期鉴定其性别并成功地将胚胎移入雌鼠体内[4]。20世纪80年代末,Handyside率先对人类胚胎进行显微操作,为一对高遗传风险的X-性连锁疾病夫妇的胚胎进行卵裂球性别分析,植入女胚,并于1990年诞生了世界上首例PGD婴儿。90年代后期,PGD逐渐普及,并可常规用于40多种遗传病的诊断,包括:单基因疾。缒倚韵宋;X染色体连锁疾。缍攀霞∮涣;染色体结构异常,如非整倍体。

1.2优势PGD目的是使有家族遗传病的夫妇可以拥有一个健康的孩子。试管婴儿(invitrofertilization,IVF)临床上的挑战是选出有活力的胚胎并优先将其植入子宫,目前,大多IVF实验室采用形态学评估来确定哪些胚胎可以植入。但未能提供有关染色体复制数目的信息,而这些信息对细胞成活具有很重要的影响[5]。PGD弥补了传统方法的不足,通过染色体基因分析,确保胚胎质量。细胞浆内精子注入后,经PGD出生儿与未经PGD出生儿在妊娠和出生指标上均具有可比性。PGD是避免遗传病患儿出生的安全方法。其优点主要体现在:(1)非侵入性,可避免常规的产前检查如绒毛取样、羊膜腔穿刺活检、羊膜腔穿刺的手术操作所带来的出血、流产、宫腔感染等并发症的危险;(2)把遗传学疾病控制在胚胎发育的最早阶段,避免了早期或中期妊娠再行产前诊断结果阳性时使孕妇面临意愿性流产所带来的生理和心理上的创伤;(3)可以排除患病胚胎和携带缺陷基因的胚胎,从而可使有遗传风险的夫妇得到完全健康的后代;(4)相对于对胎儿进行人工流产,销毁有遗传缺陷的胚胎更易为舆论、伦理所接受;(5)在胚胎器官分化之前对疾病作出诊断为进行基因治疗提供可能[6]。

1.3不足PGD的应用解决了部分有染色体异常或单基因疾病患者的生育问题,明显降低了自然流产率,减少了染色体异常的畸形儿、有遗传疾病的患儿的出生。然而这些患者的抱婴率并没有明显的提高。原因主要有:(1)活检材料的代表性不足;(2)分析技术缺陷造成误诊。PGD遇到的最大的问题是误诊的问题。迄今为止,已有2例囊性纤维化的诊断错误,1例性别诊断,1例强直性肌萎缩,1例地中海贫血,1例21三体的诊断错误,可能是由于污染或者染色体嵌合型造成误诊。许多研究发现,卵裂阶段的人胚存在较高比例的嵌合体[7],等位基因脱失(alleledrop-out,ADO)是导致误诊的主要原因。此外,关于活检的安全性也遭到了一些学者的质疑。在许多国家,PGD较产前诊断受到更多的限制,这些国家认为PGD是婴儿设计。使用PGD技术进行性别选择将有可能导致性别比例失调,特别在一些偏爱男孩的国家。此外,随着人类基因组计划的推进,人们不仅能了解致死疾病的单基因突变,同时揭开了身高、智力、长相等的遗传奥秘。有些夫妇为了选择一个优秀的子代,对子代的智商、身高、肤色、胖瘦、长相等进行选择,将不可避免地导致非医学指征胎儿的出生。伦理学方面亦有很多争论。针对目前研究者往往仅关注胚胎的生理质量而忽视伦理选择的现象,应考虑用伦理的视角审视实施胚胎植入前遗传学诊断的行为,赋予生命科学行为必要的伦理思想。因此应当权衡利弊,谨慎确定PGD的应用范围,建立适合我国国情的PGD技术及伦理操作指南[8]。

2植入前诊断的步骤

2.1活检通过IVF结合ICSI。实际上,ICSI因其可减少父源性污染,被建议用于所有PGD周期中。可通过三种方法打开透明带:机械法、化学法或激光法。清楚可视的细胞核将引导对卵裂球进行有选择的活检。第一、二极体和第三天的单细胞胚胎活检用于评价人胚胎整倍体曾经是最常用的。最近,一些项目开始将极体活检与第三天单细胞分析相结合运用[9];也有文献报道运用第三天双细胞活检[10]或囊胚泡活检[11]。还有学者提出了间接诊断:取材于胚胎的生化标记物或产物,如酶、蛋白质等,间接地对胚胎进行遗传学分析。这种无创方法的优势在于胚胎不需活检,不存在因显微活检技术影响胚胎远期发育的潜在危险性。采用此法行PGD有两个必要条件:(1)检测的基因在植入前胚胎发育阶段转录及表达活跃;(2)胚胎的基因产物水平不同于卵子胞浆的基因产物水平,而且这种差异能被检测出来。但关于体外植入前胚胎分泌的基因产物的研究甚少,此法目前仍未被用于人类胚胎[12]。

2.2分析技术

2.2.1单细胞多聚酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)单细胞PCR主要用于诊断单基因性疾病和胚胎性别。PCR扩增后用于后续基因诊断的方法主要有:(1)根据有无特异性目的条带作出诊断;(2)多态性分析;(3)等位基因寡核苷酸特异探针(allelespecificOligonucleotide,ASO)斑点杂交及反向斑点杂交(reversedotblot,ROB);(4)单链构象多态性(single-strandconformationpolymorphismanalysis,SSCP)及变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectro-phoresis,DGGE)等。

2.2.2免疫荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridisation,FISH)目前,FISH主要应用于植入前遗传学筛查、染色体结构异常及性连锁遗传疾病的性别鉴定。但是,关于PGD的远期安全性仍存在很多争议[13]。

2.2.3全基因组扩增(WGA)通过非选择性扩增微量组织或单个细胞的整个基因组DNA,在反映基因组全貌的基础上最大限度地增加其含量,以提供足量DNA模板进行后续分析。WGA发展至今形成了两种类型:(1)以PCR为基。褂盟婊锘虿糠炙婊锿ü妊防┰龅囊镅由煸だ┰(primerextensionpreamplification,PEP)和简并寡核苷酸引物PCR(degenerateoligonucleotideprimedPCR,DOP-PCR);(2)不以PCR为基。褂盟婊锖阄吕┰龅亩嘀刂没焕┰(multipledisplacementamplification,MDA)。其中,尤以MDA为PGD技术开辟了一条全新的途径。

2.2.4比较基因组杂交(com-Parativegenomichybridization,CGH)该法可检测待检全染色体组各位点遗传物质的增加和缺失,可诊断单细胞的全基因组中任何超过20Mb的染色体域的拷贝数异常,已有成功应用的报道[14]。新发展的mi-croarray-CGH可检测到一些不能被传统方法检测到的微重复和缺失[15]。

2.2.5微测序技术(mini-sequencing)又称为单核苷酸引物延伸法(singlenucleotideprimerextension,SnuPE),通过微测序技术与其他技术的结合,已经能够诊断一些单基因疾。缒倚韵宋、视网膜母细胞瘤等,并应用于临床PGD中[16]。

3应用进展

3.1国外国外资料表明,可能生育患有遗传性疾病后代的高危夫妇,在胚胎植入前行PGD,其新生儿先天畸形发生率降低为5.0%~6.0%,与人群发生率相同[17]。目前,全球已成立了40多个PGD中心。至2004年8月,全世界完成了7000多例PGD,出生了1000多个健康婴儿[18]。在欧洲,人类生殖与胚胎协会(ESHRE)PGD协作组收集的2004年45个中心的有关数据显示,共收集卵子3358个,1192个进行了PGD周期,2087个进行了PGS。适应证:559个周期为染色体异常,113个周期为X连锁疾。520个周期为单基因病。在预示染色体异常的PGD周期中,共活检了76%的胚胎,在这些胚胎中93%给出了诊断,25%是可转移的。在预示单基因疾病的PGD周期中,共活检了71%的胚胎,在这些胚胎中88%给出了诊断,52%是可转移的。总的来说,69.6%的周期进行了胚胎种植。在法国,生物医学会(ABM)报道,70%的胚胎活检给出了诊断,其中60%的胚胎适合种植。但有关疾病及其表达有一定的偏差。2004年,ESHRE最终报道PGD的种植率为17%,低于进行ICSI的IVF中观察到的种植率。报道的临床妊娠率为提取卵细胞的18%,种植胚胎的25%,最终679例成功妊娠并出生了528个婴儿[19]。有关PGD婴儿的后续儿科学队列研究甚少,可获得的资料显示:2岁时,与行IVF-ICSI的儿童相比,PGD儿童在精神与智力发育上并无差异。[20]。目前看来,PGD婴儿出生后并没有因为在胚胎期移除了一两个细胞而出现新生儿问题或者畸形[21]。

3.2国内

3.2.1必要性我国是世界上人口最多的国家,约占全世界人口总数的1/5。据2001年的调查显示,我国每年出生的2000万新生儿中,1.3%(约26

万人)患有严重的先天畸型,其中70%~80%(约19.5万人)和遗传因素有关[22]。由此可知,PGD技术在我国必然有着广阔的应用和发展前景。

3.2.2进展近年来,我国辅助生殖技术也不断进步,1992年5月,我国首例配子子宫腔内移植婴儿在广州中山大学附属医院分娩,但技术未推广。1992年6月12日,首例赠卵试管婴儿诞生;1995年2月6日,首例冻融胚胎试管婴儿诞生;1996年9月8日,首例代孕试管婴儿诞生;上述成果均来自北医三院。1989年,放弃腹腔镜取卵,阴道镜下经阴道取卵成为常规手术。经过20年的努力,临床妊娠率由1987年6.2%(2/32)和1988年4.4%(2/45),发展到目前35%~45%,活产率25%[23]。我国首例经PGD的女婴于1998年在中山医科大学生殖医学中心诞生。整体上说,我国PGD的发展相对缓慢,限制了PGD的应用,使其临床效应未能得到充分发挥。目前,全国只有3~5家生殖中心能真正将PGD作为一种常规的诊断技术,能够诊断的病种也非常有限,主要是染色体疾病。其原因除了PGD技术上的难度要求较高外,缺乏有关技术或程序的标准化规范也是限制PGD临床应用的一个因素。通过文献检索发现,我国大陆广东、上海、湖南、浙江、河南、山东、云南均报道了PGD周期的成功案例,所诊断的疾病有:杜氏肌营养不良、21-三体综合征,α、β-地中海贫血,罗伯逊易位,非整倍体筛查,Y染色体微缺失及染色体相互易位等。1999年,中山大学生殖中心应用成熟的显微操作技术进行胚胎细胞活检,活检的单个卵裂球用荧光定量PCR技术进行诊断,获得国内首例α地中海贫血胚胎种植前基因诊断后妊娠成功[24]。2003年,该中心应用单细胞多重巢式PCR技术对β地贫进行植入前遗传学诊断,达到优生目的[25]。广西妇幼保健院生殖中心与中山大学第一附属医院生殖中心合作,采用跨越断裂点PCR技术对α地中海贫血携带者夫妇进行PGD获得临床妊娠,为广西地贫的预防提供了一个可供选择的方法[26]。中南大学钟昌高等采用巢式PCR分别扩增患者和携带者的单个淋巴细胞、行体外授精-胚胎移植治疗的健康志愿捐献者的单个卵裂球细胞的DMD基因48号外显子缺失位点,建立稳定的经单细胞基因诊断DMD的方法;进一步对在该中心接受超排和体外授精-胚胎移植治疗的DMD携带者的胚胎活检后完成PGD,根据诊断结果选择健康的优质胚胎移植入子宫,达到了阻断DMD患儿出生的目的[27]。山东省立医院颜军昊等运用2l号染色体着丝粒探针荧光原位杂交技术对生育过21三体患儿的高育龄妇女的胚胎进行植入前遗传学诊断,避免了非整倍体患儿的出生[28]。郑州大学李刚等应用FISH方法进行PGD,预防遗传病高危夫妇流产和染色体异常患儿出生取得了进展[29]。浙江大学徐晨明等应用探针对卵裂球进行荧光原位杂交分析,对罗伯逊易位患者进行PGD,防止了患儿出生[30]。

4限制发展的因素

虽然分子生物学技术已广泛应用于胚胎植入前遗传学诊断,但依然存在一些不足或难点。主要包括:(1)PGD中单细胞的实验条件要求高;(2)信号缺失或重叠;(3)染色体异常时,仍然只能针对特定的一条或几条染色体;(4)探针制备技术比较困难,费用昂贵,探针的种类远远满足不了临床中染色体无穷无尽变化的需要;(5)技术开展起来,费用相对比较昂贵[31];(6)受单细胞诊断技术的限制,准确率不能达到100%[32];(7)污染是影响基因病诊断,产生误诊及诊断失败的另一个重要因素。5结语我国的PGD研究发展还有很大的潜力,仍有许多未知领域值得去探索。技术方面,更好的应用现代科学技术,将生殖医学与遗传学、分子生物学、组织胚胎学等更好的结合,建立起成熟准确的PGD技术与流程,并将其规范化推广;经济方面,降低成本,让更广大的不孕不育、遗传病患者从中受益;伦理方面,严禁"胎儿设计"和非医学的性别选择,合理运用辅助生殖技术。我们相信在不远的将来PGD会成为普遍的技术,造福患者。


学术网收录7500余种,种类遍及
时政、文学、生活、娱乐、教育、学术等
诸多门类等进行了详细的介绍。


现代妇科发展论文
@2008-2012 学术网
主机备案:200812150017
值班电话
0825-6697555
0825-6698000

夜间值班
400-888-7501

投诉中心
13378216660
咨询电话
唐老师:13982502101
涂老师:18782589406
文老师:15882538696
孙老师:15982560046
何老师:15828985996
江老师:15228695391
易老师:15228695316
其它老师...
咨询QQ
89937509
89937310
89903980
89937302
89937305
89937307
89937308
业务
综合介绍
论文投稿
支付方式
常见问题
会员评价
关于我们
网站简介
版权声明
友情链接
人员招聘
联系我们