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白细胞在妊娠期中的作用

 论文栏目:现代妇科发展论文     更新时间:2012-10-28 16:10:48   

本文作者:马佳佳 Nick Lu 陈必良 单位:第四军医大学西京医院妇产科 Department of Allergy-immunology

妊娠合并哮喘是妊娠合并症中最常见的一种,其发生率为3%~8.4%,且在世界各地呈上升趋势[1]。哮喘喘息发作特别是重症哮喘和哮喘持续状态,可对胎儿和孕妇造成不良影响,评价哮喘妇女与非哮喘妇女妊娠结局的对照研究显示,妊娠期哮喘妇女发生子痫前期、低出生体重儿和早产的危险性增加,围生期死亡率较非哮喘女性高出2倍[2]。研究认为,妊娠可能激活易感女性体内与哮喘相关的炎症途径,导致并加重孕产妇哮喘的严重程度[3]。CD4+T细胞是效应T细胞的重要成分,其中Th17是特异性产生IL-17的T细胞亚型,被认为是介导炎症反应的重要细胞[4]。研究者们发现,Th17细胞与Treg细胞相互抑制,分化发育以及功能的发挥、改变,都可能与哮喘发病有关,提示Th17/Treg细胞的稳态对维持正常免疫应答具有重要意义,但迄今为止该平衡状态与妊娠期哮喘病程变化的机制尚不明确[5]。本研究拟通过观察妊娠期哮喘小鼠模型T细胞亚群Th17及Treg细胞的变化情况,为进一步阐明Th17/Treg细胞免疫平衡在妊娠期哮喘发病机制中的调节作用提供理论和实验依据。

1材料和方法

1.1材料清洁级健康雌性BALB/c小鼠24只(第四军医大学实验动物中心),6~8周龄,体质量(20±2)g;鸡卵清白蛋白(ovalbumin,OVA,GradeⅤ,纯度>98%)、氢氧化铝[Al(OH)3]、佛波酯、离子霉素、蛋白转运抑制剂-BFA(美国Sig-ma);乙酰胆碱(methacholine,Mch,上海三爱思);电动雾化吸入器(英国葛兰素史克);FIX&Perm试剂盒(固定/破膜剂,美国CALTAGLaboratories);荧光素标记抗小鼠mAb:异硫氰基(FITC)-anti-CD4、藻红蛋白(PE)-anti-CD25、PE-anti-IL-17、别藻蓝蛋白(APC)-anti-Foxp3、PE-anti-干扰素γ(IFN-γ)及同型对照(美国BD/Pharmingen);气道阻力与肺顺应性检测系统(FinePointeRCsystem,美国BUXCO);流式细胞仪(FACSCaibur型,美国BectonDickinson)。

1.2方法

1.2.1实验分组和模型构建模型构建根据实验要求参照文献[6]方法并加以改进。按照模型构建策略及干预措施的不同,将BALB/c小鼠随机分为:妊娠期哮喘组(AP组)、非妊娠期哮喘组(ANP组)、健康妊娠组(HP组)及健康非妊娠组(HNP组),每组各6只。于实验流程的0天(实验当天)和7、14天时,分别给予AP组、ANP组腹腔注射含OVA/Al(OH)3的混悬液0.2ml[OVA100μg,Al(OH)340mg]致敏;给予HP组、HNP组腹腔注射只含5mgAl(OH)3/生理盐水(normalsaline,NS)的混悬液0.2ml致敏。之后,AP组、HP组按2∶1的比例雌雄合笼交配至妊娠成功。于实验流程的21天起,连续7天,每日将4组小鼠分别放至透明雾化箱内,AP组、ANP组以10g/LOVA/Al(OH)3雾化吸入,1次/d,40min/次进行激发;HP组、HNP组仍以等量Al(OH)3/NS雾化吸入,1次/d,40min/次进行激发以加强致敏。

1.2.2过敏反应评估依据文献[7]的方法和观察指标,监测并记录各组小鼠致敏雾化激发40min后的临床症状及生物学反应。

1.2.3肺功能检测各组小鼠于末次激发24h后开始检测,首先记录小鼠气道阻力基础值。用NS雾化1min,然后再测定小鼠经0,10,20,30,40和50g/LMch雾化激发后的呼吸间歇(enhancedpause,Penh)值,每个浓度每次雾化1min,记录3min。气道反应性指标评定均以小鼠在NS激发后增强的Penh值为基线值,以Mch相应浓度激发下的Penh值与基线值的百分比来反映。Penh值(%)=(检测Penh值-基础Penh值)/基础Penh值×100%。

1.2.4标本采集与处理小鼠肺功能检测后,摘眼球放血并收集血清,-80℃冻存备用。颈椎脱臼处死,立即行颈前暴露,分离气管并插入静脉留置针,缓慢注入1mlPBS灌洗双肺,见肺膨胀后反复抽吸3次,将回收的支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid,BALF)注入离心管中计量(回收率>80%为合格),4℃、1500r/min离心10min后收集上清,-80℃保存待测。吸取BALF中的细胞沉淀用NS重悬制备涂片,固定后行HE染色,连续计数400个细胞,计算细胞总数及嗜酸性粒细胞(eosinophils,Eos)、巨噬细胞(macropha-ges,Mac)、中性粒细胞(neutrophils,Neu)、淋巴细胞(lympho-cytes,Lym)所占百分比。BALF收集完毕后切取小鼠部分左肺组织备用。

1.2.5病理学观察取各组小鼠部分左肺组织,40g/L多聚甲醛中固定24h,脱水、石蜡包埋、切片(4~6μm)行HE染色,光镜下观察气道及肺组织炎性细胞浸润等病理改变。

1.2.6流式细胞术检测取肝素抗凝小鼠外周血100μl用RPMI1640等体积稀释,调细胞密度1×105/L接种至6孔培养板,加入佛波酯50μg/ml和离子霉素1μg/ml共同刺激,再加入蛋白转运抑制剂-BFA2μg/ml混均,37℃50ml/LCO2培养4~6h后收获细胞。按抗体说明,测定管分别加FITC-anti-CD4、PE-anti-IL-17各20μl混匀,多聚甲醛固定20min,离心去上清,10g/L皂甙破膜10min;再加FITC-anti-CD4,PE-anti-CD25及APC-anti-Foxp3各0.2μl,对照管加入相应的同型对照,4℃避光孵育30min,10g/L皂甙缓冲液洗涤1次后,离心去上清,最后以PBS/多聚甲醛重悬细胞。FlowJoV7.3软件分析Th17和Treg细胞所占CD4+T细胞比率变化。

1.2.7RT-PCR检测严格按Trizol试剂说明提取小鼠肺组织细胞总RNA,紫外光法定量检测A260/A280值,并计算RNA浓度,使用荧光定量逆转录试剂盒转录为cDNA,并以此为模板行PCR扩增。反应体系为50μl,上下游引物序列及条件见表1。反应条件:94℃预变性3min;94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸1min,共30个循环;终末延伸72℃5min。以同时扩增的GAPDH为内参照,退火温度56℃。PCR产物用12g/L琼脂糖凝胶电泳检测45min,每组实验重复6次,采用Gel-pro软件分析RT-PCR条带平均灰度值并拍照,计算目的基因/GAPDH灰度比值,比较各样本相对吸光度值并进行半定量分析。

1.3统计学处理用SPSS13.0软件统计分析数据。计量资料以x珋±s表示,多个样本组间比较采用单因素方差分析,两组间样本均数比较采用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1雾化激发后行为变化经致敏并激发后,HNP组无明显过敏性反应;HP组多数未见明显异常,仅个别小鼠偶见头面部搔痒、烦躁不安等轻微反应。AP组和ANP组过敏性反应较重,于激发10min开始即出现搔抓头、鼻、面部及躯干,明显烦躁不安,随着刺激时间的延长,呼吸加深、加快,表现为少动,前肢缩抬,腹肌抽搐,大、小便失禁,眼及口周组织浮肿,严重者对外界反应迟钝,呼吸减慢或节律不规则,四肢瘫软甚至瘫痪。

2.2气道反应性表现末次激发24h后,各组小鼠基础肺阻力无显著差异,随着Mch给药浓度逐渐增加,各组小鼠Penh值均出现随Mch浓度升高而气道反应性增强趋势。Mch以0,10g/L激发时,各组组间Penh值差异不明显。AP组从Mch30g/L开始,ANP组从Mch20g/L开始Penh值即明显高于HP和HNP组(P<0.01)。尤其当Mch浓度达到40或50g/L时,ANP组小鼠气道反应性最高,表现出敏感且过强的支气管平滑肌收缩反应,Penh值也高于AP组(P<0.05)。见图1。

2.3BALF中细胞计数和分类比较与HP组、HNP组相比较,AP组、ANP组BALF中Mac百分率均显著降低(P<0.05);白细胞总数明显升高,Neu、Eos和Lym增加,其中尤以Eos百分率增高显著(P<0.01)。AP组与ANP组,HNP组与HP组组间比较,差异均无统计学意义。见表2,图2。

2.4肺及气道组织病理形态学变化光镜下观察可见,AP组病变严重、广泛,细支气管黏膜及下层伴行血管周围有大量炎性细胞浸润,以Eos浸润为主,支气管管腔内可见黏液栓堵塞,纤毛排列紊乱,上皮下基底层明显增厚,上皮细胞、平滑肌细胞肥大增生,气道上皮细胞坏死、脱落,肺泡间隔不同程度增宽,部分断裂,形成肺气肿(图3A);ANP组也存在类似变化(图3B);HP组仅呈现很轻微的形态学改变,部分支气管黏膜轻度水肿,偶见炎性细胞浸润,支气管内皱褶减少及少许上皮脱落(图3C);HNP组结构清晰、形态规则,基本无炎性细胞浸润(图3D)。

2.5肺组织中相关细胞因子mRNA表达所检测小鼠肺组织中各细胞因子mRNA表达结果显示,AP组IL-17、IL-23、IL-10均显著高于HP组、HNP组(P<0.01);IFN-γ均显著低于HP组、HNP组(P<0.01);ANP组肺组织各因子表达变化趋势与AP组基本相同,组间无显著差异。见表3,图4。

2.6Th17及Treg细胞比率变化小鼠外周血中Th17及Treg细胞所占CD4+T细胞比率结果显示,与HP组、HNP组相比较,AP组CD4+IL-17+T细胞(Th17)比值显著升高(P<0.01);而Foxp3+T细胞(Treg)比值显著降低(P<0.01);CD4+IL-17+/Foxp3+T细胞比值显著升高(P<0.01),提示存在Th17/Treg比例失衡。ANP组Th17及Treg细胞比例与AP组无显著差异。见图5。

2.7相关性分析与气道炎性指标相关分析表明,AP组小鼠肺组织中IL-17mRNA表达水平与BALF中的Neu、Eos绝对值呈显著正相关(r=0.756,P<0.05;r=0.819,P<0.01)。

3讨论

一直以来,Th1/Th2平衡理论作为哮喘发病机制的核心假说得到了众多基础研究和流行病学调查结果的支持[8],然而,模式化的Th1/Th2失衡学说不足以解释哮喘基础与临床研究中的全部现象。研究发现,将Th1细胞过继转移给OVA致敏的受体小鼠,不仅不能拮抗Th2诱导的气道高反应及炎症,反而可引起更为严重的气道炎症[9]。随着免疫学的发展,人们对CD4+T细胞及其亚群的生理作用以及在妊娠和妊娠相关性疾病中的机制有了更深的认识。Th1/Th2模式被不断更新充实,最重要的是Th17亚型的补充。新近研究表明,CD4+T淋巴细胞中仅介导一系列炎症反应的Th17能分泌IL-17,且具有更强的致炎性,被认为是T细胞调节Neu参与哮喘炎症反应的中介,通过动员、募集和活化Neu促进局部组织产生Neu相关趋化因子,加重局部炎症反应,IL-17诱导的信号传导途径在机体免疫致敏过程中是不可或缺的重要纽带[10]。正常妊娠生理是全身各系统参与的复杂过程,妊娠各种生理性和免疫调节改变都可引发和(或)扩大哮喘的炎症反应,造成不良妊娠结局[11]。如淋巴细胞增生性反应功能以及自然杀伤细胞的活性下降、辅助T淋巴细胞数量减少等,对胎儿在宫内生长及妊娠得以维持有重要的意义。资料显示,妊娠合并哮喘对孕妇的影响较非妊娠期哮喘对患者的影响要大,哮喘的一些并发症也较非妊娠期明显增加。妊娠合并哮喘者早产发生率为4%~44%;新生儿体重较对照组平均体重减少400g;胎儿宫内死亡率可达2.6%~12%。目前,蛋白组学的分析提示,许多循环蛋白对母体哮喘的存在和胎龄的变化具有特异性[12],潜在影响孕妇哮喘和胎盘功能,最终使妊娠哮喘患者粒细胞、单核细胞的循环水平及功能发生变化,妊娠期哮喘介导细胞免疫功能降低的同时也使母体对外来病原体的免疫作用相应下降,显著增加了孕妇易患哮喘的几率和妊娠风险。本研究在成功构建妊娠哮喘模型的基础上,发现AP组肺组织、BALF和血清中IL-17mRNA及蛋白水平虽低于ANP组,但均明显高于对照组;各细胞因子水平变化趋势也与ANP组基本一致,且BALF中Neu,Eos计数和气道炎症指标呈正相关。此结果与文献[9,13]所证实的结论一致,说明CD4+T细胞在妊娠哮喘发生后激活并过表达Th17分泌的IL-17,上调黏液基因表达促进黏液分泌,增加了妊娠哮喘气道高反应性、黏液分泌及Neu的浸润,Th17/IL-17比例增加而Treg细胞数量减少很可能是导致妊娠哮喘发生发展的另一个重要原因。近年来,介导免疫耐受调节的Treg细胞,其数量和功能降低与哮喘发生、发展密切相关的研究进展逐渐引起人们的关注。Treg作为具有免疫抑制活性的T细胞亚群,与Th17的共同作用决定了妊娠哮喘的发展方向[14]。Th17/Treg的平衡状态及在整个孕期呈现不断变化的动态过程,使母体免疫系统处于有利于妊娠和母体免疫稳态的维持,当发生妊娠哮喘时全身Treg存在系统降调节[15],不能强有力地抑制下调Th17细胞增殖及其细胞因子的分泌。因此,CD4+CD25+Treg在妊娠期哮喘治疗中具有潜在价值,有望成为新的靶点。本研究结果显示,AP组CD4+T细胞亚群中Foxp3+表达下调,CD4+IL-17+和CD4+IL-17+/Foxp3+T细胞比值均高于HP组、HNP组,但与ANP组无显著差异,表明AP组小鼠与ANP组一样,个体中都存在Th17及Treg细胞数量和功能失衡。AP组与ANP组的免疫应答均以Th17型免疫反应为主,Th17/Treg细胞比呈反相变化。由此推测,当妊娠哮喘发生时,CD4+CD25+表达Treg比例的动态变化达不到母体免疫耐受所需,效应T细胞对外界刺激的增殖反应不能有效被其反馈抑制,促使Th17/Treg比值向Th17方向偏移,通过有效抑制甚至使已经产生的Treg向Th17分化,导致妊娠哮喘的发生和发展。这种免疫系统激活以及免疫效应不足的双向性变化,可能共同导致了妊娠期哮喘的多种并发症,为妊娠期哮喘的病因研究、诊断及免疫治疗提供理论依据。总之,CD4+T细胞亚群之间的平衡状况在妊娠哮喘中扮演何种角色,其是否是Th17/Treg细胞因子平衡的关键所在,还需更深入的探索和验证。相信研究CD4+T细胞亚群表达失衡将有助于加深认识妊娠期哮喘发病的调控机制,以从免疫机制入手预防和治疗妊娠期哮喘,将是一个重要的突破口。


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